近年来研究发现维生素K2可防治中老年骨质疏松症、骨质疏松性骨折。但对生长期钙缺乏机体的研究较少。伊利联合四川大学华西公共卫生学院，通过生长期钙缺乏动物模型，深入探讨甲基萘醌-7（menaquinone-7，MK）对生长期钙缺乏大鼠骨健康的影响及其作用机制。
      2023年7月，该项研究成果在影响因子5.9的国际学术期刊《Nutrients》上发表。

一、研究主要发现

      生长期钙缺乏显著降低骨质量，损伤骨微观结构；并显著改变了粪便菌群的群落丰富度和构成及盲肠和肱骨的代谢轮廓。
      MK与维生素D联用可在钙不足（75%推荐值）的情况下，部分弥补钙缺乏对股骨骨密度和皮质骨微观结构的不利影响。
      10 mg/kg.bw的MK可显著提高生长期钙缺乏大鼠的骨钙含量并改善皮质骨微观结构，降低未羧化骨钙素含量及比例。MK对骨质量有益的作用机制涉及调节代谢和肠道菌群。

二、研究背景

      生长阶段充足的钙摄入是增加骨峰值的核心条件。因此在20岁之前增加骨峰值对预防骨质疏松至关重要，这也使得生长期成为“投资”骨骼健康的最佳时期。但研究表明生长阶段钙摄入不足的情形在全球广泛存在。我国全国性调查显示我国4-17岁儿童的钙摄入量低于平均需要量的比例高达96%，如11-13岁儿童的摄入量中位数为317 mg/d，仅占钙该人群EAR数值的31.7 %。

      MK是目前关注度较高的一种维生素K2。维生素K2可由肠道细菌合成或由维生素K1在体内转换而成。目前，我国、欧盟、美国等国家或地区均已批准将维生素K2作为营养强化剂添加到食品中。多项动物实验和临床研究显示维生素K2可以抑制骨质疏松模型大鼠的骨密度或者骨矿物质含量的丢失，增加骨形成，改善骨力学性能。但是，MK作用于健康人群和儿童的研究则更少。此外，动物实验和人群研究发现维生素K和维生素D联用的效果比单一补充效果更佳，但结果不一致。一项Meta分析了8项随机对照研究后，发现维生素K和D联用可通过增加骨密度和提高骨钙素的羧化率来改善骨骼质量。这与美国药典委员会的意见一致，即钙、维生素D、维生素K2三者的比例恰当很重要。但目前，有关的证据极少。

      综上，有关MK单独，或与VD联合使用对骨质疏松个体骨质量的作用的研究结果尚不一致，对生长期儿童骨量积累的文献更少。

三、研究方法

      选用刚断乳SD雄性大鼠72只适应两周后随机分为低钙组（LC，饲料钙0.15%），正常组（NC，饲料钙0.5%），对照组（RC，饲料钙0.375%+维生素D3），低MK组（LMK组）、中MK组（MMK组）和高MK组（HMK组）6个组，分别饲喂含不同钙和维生素D3含量的饲料。MK三组在对照组饲料的基础上，分别灌胃0.1、1.0和10.0 mg/kg.bw的MK共计13周。实验第83天进行3天钙代谢实验。大鼠在实验93天处死，检测血清中钙、CTX、羧化骨钙素和未羧化骨钙素（Glu-Osteocalcin, Glu-OC）等多种骨代谢标志物的水平；取股骨测定干重、骨钙和骨密度；采用micro-CT检测骨皮质和骨松质微观结构参数。取盲肠内容物和粪便采用16s rRNA基因测序分析肠道菌群；取盲肠内容物和肱骨采用UHPLC-Q/TOF-MS进行非靶代谢组学检测。进而关联分析肠道菌群差异菌、肱骨/盲肠差异代谢物和骨质量参数，构建差异微生物-差异代谢物-骨质量的关联网络。研究的分组及具体路线图见图1。

图1

四、研究结果

4.1 大鼠一般情况及钙代谢

      低钙组的大鼠在干预一个月后即开始出现局部脱毛的现象。各组实验期间均未观察到其他异常情况。从5周到13周，LC组体重显著低于其他5组（P < 0.05）。MK-7补充对小鼠的体重、心、肝、脾系数无显著影响。

      钙代谢试验中，低钙组的钙表观吸收率和钙储留率显著高于其他五组（P均< 0.05）。低MK组、中MK组、高MK组的钙表观吸收率和钙储留率与对照组无显著差异。

4.2 大鼠骨质量

      高MK组的股骨重量显著高于对照组（P < 0.05），且与正常组无统计学差异。正常组、对照组、MK三组的骨钙含量均显著高于低钙组（P均< 0.05）。高MK组骨钙含量显著高于对照组（P < 0.05），且与正常组无统计学差异。结果提示MK干预可改善生长期大鼠骨钙含量。

      MK三组的骨密度显著高于低钙组（P < 0.05），但与对照组和正常组相比无差异。值得关注的是，对照组的骨密度显著低于正常组，但MK三组的骨密度与对照组无显著差异。结果提示，当MK与VD联用时可在钙不足（75%推荐值）的情况下，弥补钙不足对骨密度的不良影响。各组骨密度的比较图见图2。

图2

4.3 大鼠骨微观

      在MK干预组中，大鼠股骨骨小梁体积、数量和骨体积分数水平呈剂量依赖性上升。其中，高MK组的骨小梁体积、数量和骨体积分数显著高于低钙组（P均< 0.05），但与正常组和对照组统计学无差异（P均> 0.05）。

      同时，股骨皮质骨的各微观结构参数也呈剂量依赖性上升。其中，高MK组的Ct.Th显著高于对照组（P<0.05）。正常组、对照组以及各实验组的Ct.Ar均显著高于低钙组（P均<0.05）。高MK组的皮质骨面积显著高于对照组（P<0.05）。对照组的Ct.Th和Ct.Ar显著低于正常组（P均<0.05），但高MK组的Ct.Th和Ct.Ar与正常组无统计学差异，结果提示高剂量的MK与VD联用时，可弥补钙不足对皮质骨微观结构的不良影响。各组大鼠典型Micro-CT的比较图见图3。

图3

4.4 营养状况标志物、骨代谢标志物

      中MK组的血钙水平显著高于正常组和对照组（P均< 0.05）。中MK组和高MK组的ALP浓度显著低于对照组（P < 0.05）。中MK组和高MK组的CTX显著低于低钙组和对照组，其中高MK组的CTX显著低于正常组（P < 0.05），提示MK组可有效降低骨吸收作用。

      对照组的未羧化骨钙素显著低于正常组（P < 0.05）。低、中、高MK剂量组的未羧化骨钙素水平和未羧化骨钙素/羧化骨钙素比值均显著低于低钙组、对照组和正常组（P均< 0.05），说明MK显著的降低了大鼠体内的未羧化骨钙素水平。这与较多研究结果一致，结果说明MK可通过羧化谷氨酸残基，并进一步改善骨形成，使得钙在骨骼上更有效的实现沉积和矿化。各组比较图见图4。

图4

4.5 粪便及盲肠肠道菌群

      钙缺乏显著改变了粪便菌群的群落丰富度和构成。与对照组相比，高MK组的α多样性指数与对照组无统计学差异，提示高剂量的MK干预13周后未对盲肠的多样性和群落丰富度有显著影响，但显著改善了粪便菌群的构成。在属水平上，MK干预后降低了粪便中的增加了杜氏杆菌属（Dubosiella）、norank_f_Muribaculaceae和norank_f_Erysipelotrichaceae的丰度，降低了GCA-900066575的相对丰度。HMK干预后增加了盲肠中大肠埃希菌－志贺菌属（Escherichia-Shigell）和毛螺菌科_UCG-010（Lachnospiraceae_UCG-010）的丰度，降低了细小杆菌（Parvibacter）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和另枝菌属（Alistipes）的相对丰度。肠道菌群的多样性及物种差异见图5。

图5

4.6 盲肠与肱骨的非靶代谢物

      钙缺乏显著改变了盲肠和肱骨中的代谢轮廓，而高MK干预则改善了此种变化。采用spearman对MK干预后的特征菌群、差异代谢物与骨质量指标进行关联分析，结果发现细小杆菌和GCA-900066575的相对丰度与盲肠和肱骨中显著增加的脱氢表雄酮、股骨骨钙含量等多个骨质量指标显著相关。非靶代谢组学的结果见图6。

图6

五、研究结论

生长期大鼠钙缺乏使得股骨重、骨钙和骨密度显著降低，骨微观结构明显受损。钙缺乏也显著改变了粪便菌群的群落丰富度和构成及盲肠和肱骨的代谢轮廓。10 mg/kg.bw的MK可显著提高生长期钙缺乏大鼠的骨钙含量并改善皮质骨微观结构，降低未羧化骨钙素含量及比例。联合应用VD和MK可部分纠正25%钙缺乏对股骨的不良影响。除了促进骨钙沉积和减少骨吸收外，MK促进骨健康的作用机制还涉及到调节宿主的代谢途径和肠道菌群。

参考文献
Yuan Y, Szeto IM, Li N, et al. Effects of Menaquinone-7 on the Bone Health of Growing Rats under Calcium Restriction: New Insights from Microbiome-Metabolomics. Nutrients. 2023 Jul 31;15(15):3398.