母乳尚有很多未被发现的奥秘，对母乳和牛乳中各种生物活性成分的差异全面系统的比较分析，可为婴儿配方粉更好地模拟母乳提供理论依据，伊利母婴营养研究院致力于母乳的深入研究，曾发表过多项母乳蛋白质组学研究的前沿研究成果，2019年，伊利母婴营养研究院与国内研究乳蛋白质组学的权威学术团队，沈阳农业大学食品科学院再次联合发表国家课题的研究成果，进一步揭示了母乳和牛乳中N-糖蛋白差异，研究发表于Food Chemistry(IF: 6.306)，这项前沿的研究发现是国内乳企首次报道人乳与母乳N-糖蛋白的结构差异，再次刷新了我们对母乳的认知^[1]。

蛋白质糖基化及其作用

    蛋白质是母乳中的重要成分，而蛋白质糖基化是一种常见的蛋白翻译后修饰，糖基化修饰可影响蛋白质的结构和生理特性，进而影响蛋白质的功能。糖基化的作用具体体现在以下三个方面：

①使蛋白质能够抵抗消化酶的作用；

②赋予蛋白质传导信号的功能；

③部分蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。因此，蛋白的糖基化可影响体内的多种生物过程，包括免疫防御、病原体结合、细胞生长和细胞粘等。

    通过糖蛋白组学研究母乳中蛋白的糖基化，及比较与牛乳中的差异，可深入了解母乳，为婴儿配方奶模拟母乳提供重要的参考价值。糖基化具体分为N-糖基化和O糖基化（详见图1），而N-糖蛋白是指经N-糖基化修饰的蛋白质，该项研究聚焦在母乳和牛乳中的N-糖蛋白差异。

图1.N-糖基化和O糖基化^[2]（寡糖与4种氨基酸连接(天冬酰胺、Ser、Thr和Hyp)发生的反应为糖基化。N-糖基化：与天冬酰胺残基的NH₂连接；O-糖基化：与Ser、Thr和Hyp的OH连接）

研究方法

    该研究收集母乳和牛乳的初乳和成熟乳各60份，采用凝集素富集法和高分辨率液相色谱法-质谱联用（LC-MS/MS）相结合的方法，对来自于人和牛的初乳和成熟乳乳清中的N-糖蛋白组进行鉴定，并对鉴定结果进行生物信息学分析，详细的研究方法和步骤见图2。

图2.研究方法与步骤

研究结果

1、N-糖蛋白及糖基化位点的鉴定

    在人初乳和成熟乳、牛初乳和成熟乳的乳清组中，分别鉴定出68、58、100和98个N-糖蛋白。在所有的样本组中,约70%左右的N-糖蛋白肽只有一个糖基化位点。牛成熟乳中N-糖基化程度最高的蛋白质含有5个糖基化位点，人初乳和成熟乳中的聚合免疫球蛋白受体(PIGR)和牛初乳中的簇蛋白(CLU)的N-糖基化程度最高，各有9个N-糖基化位点(图3)。这提示我们，人、牛初乳和成熟乳中免疫相关的N-糖蛋白存在差异，也反映婴儿和牛犊在不同阶段免疫系统发育的营养需求存在差异。这也未来婴配粉的创新，比如在婴儿发育的不同阶段，往牛乳基婴儿配方粉中添加免疫相关N-糖蛋白提供了理论依据和研究基础。

图3.样本中N-糖蛋白不同数目糖基化位点的占比

2、N-糖蛋白基因本体分析

    通过基因本体分析的方法对所鉴定的N-糖蛋白的属性和功能进行注释，主要立足于N-糖蛋白作为细胞组件、分子功能及生物过程的作用。结果显示，4种样品类型中N-糖蛋白共同的生物过程包括细胞定位、应激反应、免疫过程和细胞粘附。人初乳和成熟乳中的许多N-糖蛋白参与了单组织过程，牛初乳中的多种N-糖蛋白参与了应激反应，成熟乳中的大多数N-糖蛋白与生物过程调控有关(图2)。

图4.基因本体分析结果。人初乳(a), 人成熟乳(b), 牛初乳(c), 牛成熟乳(d).

BP：生物过程; CC：细胞组件; MF：分子功能。

3、KEGG信号通路分析

    KEGG信号通路分析是基于生物信息学的分析方法，将所鉴定的蛋白与信号通路蛋白数据库进行比对分析，从而分析目标蛋白的潜在功能。分析结果显示，补体和凝血级联途径、金黄色葡萄球菌感染和细胞外基质受体相互作用途径在人、牛初乳和成熟乳中是共有的。

图5.KEGG信号通路分析。人初乳(a), 人成熟乳(b), 牛初乳(c), 牛成熟乳(d).

4、人乳和牛乳N-糖蛋白的差异

    为了进一步阐明人乳和牛乳清N-糖蛋白组的相似性和差异性，该研究进一步比较了不同泌乳期牛乳和人乳的差异。结果显示，仅有18个N-糖蛋白(12.0%)和6个N-糖蛋白肽(2.2%)是人初乳和牛初乳中均存在，50个N-糖蛋白(33.3%)和105个N-糖蛋白肽(38.6%)仅在人初乳中鉴定出，而82个N-糖蛋白(54.7%)和161个N-糖蛋白肽(59.2%)仅在牛初乳中被鉴定。

    仅有16个N-糖蛋白(11.4%)和11个N-糖基化肽(4.9%)在人和牛成熟乳中均存在，42个N-糖蛋白(30.0%)和85个N-糖基化肽(37.9%)仅在人成熟乳中鉴定出。此外，在牛成熟乳中，82个N-糖蛋白(58.6%)和128个N-糖基化肽(57.1%)仅在牛成熟乳中被鉴定出来(图6)。

图6.人乳和牛乳N-糖蛋白和N-糖基化肽的维恩图。HC：人初乳；BC：牛初乳；HM：人成熟乳； BM：牛成熟乳

研究的意义和价值

    该研究通过鉴定母乳和牛乳中N-糖蛋白的数量，比较不同泌乳期的人和牛的乳清N-糖蛋白组的异同。提示我们，N-糖蛋白组在人乳和牛乳的不同泌乳期有所不同，尤其是免疫相关的N-糖蛋白。通过研究，可以提高我们对来源于人乳和牛乳的初乳和成熟乳中N-糖蛋白的性质和生物学功能的理解，并有助于深入了解，在未来条件允许的情况下，在婴儿不同发育阶段的配方粉中添加N-糖蛋白的潜在用途。

参考文献：

[1]Cao X, Yang M, Yang N, et al. Characterization and comparison of whey N-glycoproteomes from human and bovine colostrum and mature milk[J]. Food chemistry, 2019, 276: 266-273.

[2]Pezzutti D L. Characterization of the Glycosylation of Aquaglyceroporin HC-3 in Erythrocytes from the Freeze Tolerant Anuran, Dryophytes chrysoscelis[J]. 2018.https://ecommons.udayton.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1182&context=uhp_theses