母乳低聚糖由5个基本糖单元组成：D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、L-岩藻糖（Fuc）和唾液酸（Sia）。HMOs都含有一个乳糖（Gal-β-1,4-Glc）在还原末端，并在这基础上以β-1,3或β-1,6键连接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal-β-1,3-GlcNAc，此双糖结构又称为lacto-N-biose，或1型链结构）或者连接N-乙酰氨基乳糖（N-acetyllactosamine，Gal-β-1,4-GIcNAc，2型链结构）延伸糖链，形成乳酰-N-四糖（lacto-N-tetrose，LNT）、乳酰-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT）、乳酰-N-六糖（lacto-N-hexaose，LNH）等核心结构（图1）^[1]。在核心结构的基础上糖链可以被不同数目的岩藻糖和唾液酸修饰形成多种多样的寡糖结构。

图1. 部分HMOs的结构示意图^[1]

特点：HMOs在强碱性条件下以阴离子形式在阴离子交换柱上被保留和分离，与脉冲安培检测器联用，具有高分辨率、高选择性和低检测限的特点；但该方法前处理过程较为繁琐，并且其流动相体系不能直接和质谱（MS）联用，对标准品依赖较大。

应用：母乳寡糖的定量分析，尤其是对高含量的寡糖异构体的检测

特点：石墨化碳材料对寡糖能够很好地保留以及分离选择性，尤其是寡糖异构体；PGC在应用时，通常需要利用化学反应将HMOs的还原端还原，避免寡糖的α和β差向异构化对分离和检测的干扰。

应用：PGC和质谱联用广泛用于不同人群人乳寡糖轮廓分析以及其他动物乳寡糖分析；人乳寡糖绝对定量分析

3、亲水作用色谱 （Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）

特点：HILIC采用极性固定相和水溶性有机溶剂（主要为乙腈）－水为流动相，是一种新型的色谱分离手段，克服了正相色谱和反相色谱在寡糖分离过程中的不足；其溶剂系统与质谱具有很好的兼容性，并有利于增强电喷雾离子源质谱的离子化效率进而提高检测灵敏度；通常用于对衍生化HMOs的分析，该方法对HMOs异构体分离能力仍有限。

应用：人乳寡糖和动物乳寡糖轮廓分析以及定量分析

特点：具有较高的分离能力和灵敏度；衍生化之后的寡糖可结合荧光或者紫外检测器使用。

应用：分离和鉴定糖类化合物，主要应用于带电性的唾液酸化寡糖；与质谱结合可用于检测人乳和婴儿粪便中寡糖，如人乳寡糖定量及轮廓分析

三、母乳低聚糖结构鉴定技术研究^[2]

• 基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）除具有高灵敏度、快速、准确、高通量、易于实现自动化等特点外，同时还能耐受样品中不挥发性盐，不需要进行脱盐处理，简化了样品的操作过程。在离子化过程中，不易引起源内裂解，而形成准分子离子峰或准分子离子加和峰，可用于对人乳寡糖的单糖组成进行推断，也可以用于大量样本中快速的profiling分析。 

• 电喷雾质谱（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）技术显著优点是被分析物可以带多电荷，从而大大扩展了质谱的质量测定范围，不仅如此，电喷雾质谱的二级碎片结构还可以给出寡糖的连接顺序和连接键构型信息，因此常与色谱技术联用用于母乳寡糖定性定量分析及结构分析中。

NMR在解决糖类化合物的糖苷键构型、糖的种类、糖残基数目、糖与糖的连接位置、糖与糖的连接顺序等方面具有重要的作用。NMR 不需要标准品即可进行定性分析，这对于母乳寡糖中新的未知的糖定性分析具有显著地优势，但它对寡糖的纯度要求较高，且质量需在毫克级以上，在一定程度上限制了其应用。

参考文献：

[1]Bode L. Human milk oligosaccharides: every baby needs a sugar mama. Glycobiology. 2012 Sep;22(9):1147-62.

[2]闫竞宇，丁俊杰，金高娃，等。人乳寡糖的分离分析。生物技术进展，2018, 8(6): 469-76.