当地时间2019年6月5-8日，第52届欧洲儿科胃肠病学、肝脏病学和营养学学会（ESPGHAN）年会在苏格兰哥拉斯哥隆重召开。ESPGHAN年会是全球儿科胃肠病学、肝病学和营养学领域最大的会议，每届年会都会吸引来自全球100多个国家和地区的数千名胃肠病学、肝病学和营养学领域的专业人士前来参会。母乳是0~6个月婴儿最理想的食物，其中的蛋白质是人们研究和关注最多的成分之一。在此次ESPGHAN年会上，母乳蛋白质组学最新临床研究引起了参会者的广泛关注和热烈讨论。本文将对这些研究得到的新发现进行精要概述。

    杨梅等^[1]通过使用相对和绝对定量同位素标记 (Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技术，对不同泌乳时期的人乳与牛乳中乳清蛋白进行定性和定量分析。研究人员采集了人初乳（产后0-5天）、人成熟乳（产后15天-6个月）、牛初乳和牛成熟乳样本各30份。研究结果显示，人乳和牛乳中共鉴定出584种乳清蛋白，424种蛋白在不同泌乳时期的母乳和牛乳中的表达有差异（P<0.05）。这424种差异表达蛋白根据基因本体（Gene Ontology）功能注释归类为生物过程蛋白（Whey proteins in biological processes）、分子成分蛋白（Whey proteins in molecular components）和分子功能蛋白（Whey proteins in molecular functions），见图1。

    与人成熟乳相比，人初乳中有297种蛋白表达量上调；与牛成熟乳相比，牛初乳中有302种蛋白表达量上调。根据GO标注，20种免疫相关蛋白在人乳和牛乳中的表达有差异。与人成熟乳相比，人初乳中有16种蛋白表达量上调（表1）。

图1. 对人乳和牛乳里在不同泌乳时期有表达差异的乳清蛋白进行基因本体标注

表1. 免疫系统过程中的差异表达乳清蛋白

2.产后第一年母乳中酪蛋白含量变化趋势

    Liao Y等^[2]对产后第一年母乳中（88份样品）的总酪蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白进行了定量分析。研究结果显示，α-酪蛋白含量为0.04~1.68 g/L、β-酪蛋白含量为0.04~4.42 g/L、κ-酪蛋白含量为0.10~1.72 g/L。线性回归分析显示，总酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白含量随泌乳时间的延长呈逐渐下降趋势（图2）。

图2. 不同泌乳时期的总酪蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白含量

3.乳清蛋白和酪蛋白的比值处于动态变化之中

    乳清蛋白和酪蛋白的比值是婴儿配方粉的金标准，但在人乳中这个比值并不是固定不变的。乳清蛋白和酪蛋白的比值在整个泌乳期处于动态变化之中，通常作为标准的60∶40比值是正常哺乳期的近似值，变化范围从初乳（0-5d）的接近90∶10到过渡乳（6-15d）的65∶35以及成熟乳的60∶40（表2）^[3]。这是因为乳清蛋白含有人体所需的全部必需氨基酸以及多种有利于婴儿生长发育的活性物质——乳白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白等。这些活性物质在维持机体正常生长发育、增强免疫功能、促进肠道健康等方面有重要作用。

表2. 不同泌乳时期的母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比值^[3]

    Liao Y等^[2]的研究则显示，乳清蛋白和酪蛋白的比值范围从45∶55到97∶3，平均值为79∶21，中位值为77∶23。线性回归显示，母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比值随泌乳时间的延长呈逐渐上升趋势（图3）。

图3. 不同泌乳时期的乳清蛋白/酪蛋白比值^[2]

4.中国和荷兰的人乳中乳清蛋白功能的对比研究

    Elwakiel M^[4]等采集了7位中国母亲产后第1-20周和4位荷兰母亲产后第1-24周的乳汁样本，应用基于强度的绝对定量（Intensity-based absolute quantification, iBAQ）技术对人乳清中不同生物活性的蛋白进行了定性和定量分析。该项由伊利支持的研究发现，中国和荷兰的人乳中乳清蛋白含量随泌乳时间的延长呈逐渐下降趋势。初乳和成熟乳中乳清蛋白成分差异较大，但是，二者均以免疫蛋白、酶类和运输蛋白为主（图4），这三类蛋白中的15种主要蛋白含量在乳清蛋白中占95%以上。中国和荷兰母亲不同泌乳时期的乳清蛋白组成和含量显示出一定的相似性（图5）。免疫相关蛋白含量随泌乳时间的延长呈下降趋势：免疫相关蛋白在泌乳早期含量较高和新生儿免疫系统不完善相关。

图4. 7位中国母亲的乳汁中乳清蛋白组成

图5. 中国和荷兰母亲乳清中不同生物活性蛋白在不同泌乳时期的含量变化

5.乳脂球膜蛋白质组学研究

乳脂是乳汁中的重要营养成分，它以脂肪球的形式分散存在于母乳和牛乳中，外面包裹着独特的三层膜结构，称为乳脂球膜 (Milk fat globule membrane, MFGM)。杨梅等^[5]利用iTRAQ技术对中国的人乳和牛乳中的乳脂球膜蛋白进行了定性、定量和功能分析。该研究一共分析了411种乳脂球膜蛋白，其中方差分析显示232种蛋白在不同泌乳时期的母乳和牛乳中的表达有差异 (P<0.05)。通过GO功能标注，将这232种有差异表达的蛋白从生物学过程、分子成分和分子功能三个方面进行了分类（图6）。结果发现，这些蛋白分别主要对应：应激反应 (response to stimulus)、细胞外空间 (extracellular space) 和蛋白结合 (protein binding) 。相对已有研究，该项由伊利支持的研究对于人乳和牛乳中的乳脂球膜蛋白组学进行了更加深入和全面的比较，亦分析了其随泌乳时间的变化和功能分类，帮助我们更好地了解母乳中的功能成分。

图6. 对牛乳和人乳里在不同泌乳时期有表达差异的乳脂球膜蛋白进行基因本体标注

6.外泌体蛋白质组学研究

    外泌体（Exosome）是细胞分泌的纳米级（40-100nm）囊泡，内部包裹了蛋白质、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中，包括羊水、血液、人乳和牛乳等，而不同组织来源的外泌体在内容物组成和功能方面存在差异。杨梅等^[6]通过使用iTRAQ和最新的分析技术，对中国的人乳和牛乳中的外泌体蛋白进行了定性和定量分析。该研究一共分析了920种外泌体蛋白，其中575种蛋白在不同泌乳时期的人乳和牛乳中的表达具有差异 (P<0.05)。这575种差异表达蛋白根据GO功能注释归类为生物过程蛋白（Exosome proteins in biological processes）、分子成分蛋白（Exosome proteins in molecular components）和分子功能蛋白（Exosome proteins in molecular functions）。

图7. 对牛乳和人乳里在不同泌乳时期有表达差异的外泌体蛋白进行基因本体标注

    该研究还发现，根据GO标注，22种免疫相关蛋白在人乳和牛乳中的表达有差异。与牛初乳相比，人初乳中有15种外泌体蛋白（如中性粒细胞防御素1、免疫球蛋白J链、cDNA FLJ14473 fis、免疫球蛋白重链和超氧化物歧化酶）表达量上调。与牛成熟乳相比，人成熟乳中有10种外泌体蛋白（如白细胞介素- 19,40s、核糖体蛋白S19和toll样受体）表达量上调。34种转运相关蛋白在人乳和牛乳中的表达有差异。与牛初乳相比，人初乳中有17种外泌体蛋白（如溶质载体家族2、ATP合成酶δ亚基、线粒体）表达量上调。与牛成熟乳相比，人成熟乳中有29种外泌体蛋白（如Ras-相关蛋白 Rab-5B、Rab-5C、Rab-8A）表达量上调。

参考文献：

[1]Yang M, Cao X, Wu R, et al. Comparative proteomic exploration of whey proteins in human and bovine colostrum and mature milk using iTRAQ-coupled LC-MS/MS. Int J Food Sci Nutr, 2017, 68(6): 671-81.

[2]Liao Y, Weber D, Xu W, et al. Absolute Quantification of Human Milk Caseins and the Whey/Casein Ratio during the First Year of Lactation. J Proteome Res, 2017, 16(11): 4113-21.

[3]Lönnerdal B, Erdmann P, Thakkar SK, et al. Longitudinal evolution of true protein, amino acids and bioactive proteins in breast milk: a developmental perspective. J Nutr Biochem, 2017, 41: 1-11.

[4]Elwakiel M, Boeren S, Hageman JA, et al. Variability of Serum Proteins in Chinese and Dutch Human Milk during Lactation. Nutrients, 2019, 11(3). pii: E499.

[5]Yang M, Cong M, Peng X, et al. Quantitative proteomic analysis of milk fat globule membrane (MFGM) proteins in human and bovine colostrum and mature milk samples through iTRAQ labeling. Food Funct, 2016, 7(5): 2438-50.

[6]Yang M, Song D, Cao X, et al. Comparative proteomic analysis of milk-derived exosomes in human and bovine colostrum and mature milk samples by iTRAQ-coupled LC-MS/MS. Food Res Int, 2017, 92: 17-25