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    母乳中的脂肪在乳腺的分泌细胞内形成[1][2][3],分泌过程中逐渐形成具有独特的3层膜结构包裹的乳脂肪球(Milk fat globule, MFG)[4],且以乳脂肪球的形式均匀分散在乳汁中,包裹脂肪球的膜性结构被称为乳脂肪球膜(Milk fat globule membrane, MFGM),如图1所示。MFGM是由蛋白质、磷脂、酶及矿物质等组分组成的复杂混合物,其中蛋白质和磷脂占其干重的90%以上(表1)[5]。MFGM具有乳化作用,既能防止脂肪球聚集,又能够防止酶的作用,使之在乳汁中乳化分散,以维持乳脂的特殊状态[6]

 

图1. 乳脂肪球(MFG)的形成[4]

 

表1.乳脂球膜的成分含量平均估计值

 

    乳脂肪球膜蛋白即MFGM蛋白(Milk fat globule membrane proteins,MFGMP)是膜结合的蛋白,这些蛋白质主要是吸附在MFG的表面。MFGM蛋白主要包括与脂肪分化相关蛋白及具有免疫、信号传导、蛋白质运输、脂质代谢和细胞周期附着功能相关的蛋白。作为MFGM的主要组成成分,MFGM蛋白含量仅占总乳蛋白的1%-2%,和其他乳蛋白成分相比,MFGM蛋白在机体内具有不同的生物学活性且生物学活性更为复杂[7]

 

    有动物实验和临床实验显示,乳脂球膜可以促进婴幼儿的大脑发育并提升认知能力,改善代谢,以及减少胃肠道感染和提高免疫力[7]。近年来,国内外对乳脂肪球膜蛋白的研究越来越多,但是比较人乳与牛乳乳脂肪球膜蛋白及其随泌乳时间延长的变化的研究仍较少。对蛋白质进行蛋白质组学研究时,相较传统生化研究方法,同位素相对和绝对定量标记(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技术鉴定蛋白灵敏度高,对蛋白可进行定性、定量分析。

 

研究设计

 

    新近发表于Food&Function的一项由伊利支持的研究[8]旨在利用iTRAQ技术对不同泌乳期人乳与牛乳中MFGM蛋白进行定性和定量蛋白质组学分析。研究人员采集了人初乳(产后0-5天)、人成熟乳(产后15天-6个月)、牛初乳和牛成熟乳样本各30份。采集的乳样通过离心、洗涤、静置、分离、沉淀等操作提取MFGM。应用iTRAQ结合LC-MS/MS的方法对得到的MFGM进行分析。

 

研究结果

 

1.MFGM差异表达蛋白的基因本体(GO)功能注释分析

 

    研究结果显示,人乳和牛乳中共鉴定出411种乳脂肪球膜蛋白,其中方差分析显示232种蛋白在不同泌乳时期的母乳和牛乳中的表达有差异(P<0.05)。这232种差异表达蛋白根据基因本体(Gene Ontology)功能注释归类为生物过程蛋白(Proteins in biological processes,图2A)、分子组成蛋白(Proteins in molecular components,图2B)和分子功能蛋白(Proteins in molecular functions,图2C)。在这些MFGM差异表达蛋白中,有26%、19%和18%的蛋白分别参与应激反应(Response to stimulus)、定位(Localization)和定位的建立(Establishment of localization)。对于分子组成,有17%的差异表达蛋白参与细胞外间隙(Extra cellular space),17%的蛋白参与细胞外区域部分(Extra cellular region part),17%的蛋白参与细胞部分(Cell fraction),16%的蛋白参与囊泡(Vesicle)。对于分子功能,61%的差异表达蛋白具有结合作用(Protein binding),18%的蛋白具有核苷酸结合(Nucleotide binding)作用。这些结果表明,不同泌乳时期人乳和牛乳MFGM差异表达蛋白具有不同的生物功能。

 

图2. 不同泌乳期人乳与牛乳MFGM差异表达蛋白GO功能注释

原文:Fig. 1 GO annotation for differentially expressed MFGM proteins in bovine and human milk across different lactation periods.

 

2.定量MFGM蛋白的主成分分析

 

    主成分分析(Principal component analysis,PCA)显示,不同泌乳时期人乳与牛乳中MFGM蛋白有3个主成分,累计解释方差超过 88%(解释方差:PC1 53.91%,PC2 18.25%,PC3 16.20%)。PC1主要包括肽脯氨酰顺反异构酶(Q9N138),PC2主要包括HCG2032701(A0A024R3J7),PC3主要包括组蛋白H3(K7EMV3),这3个主成分能够区分不同泌乳期人乳和牛乳中MFGM蛋白。以PC1和PC2为横纵坐标作图即PCA得分图,如图3A所示。图3B所示是相关载荷(X)图,每一个点代表了一种通过iTRAQ蛋白质组学方法鉴定的蛋白。

 

图3. 不同泌乳期人乳与牛乳MFGM蛋白主成分分析图

RCM代表人常乳MFGM,RFM为人初乳MFGM,BCM为牛常乳MFGM,BFM为牛初乳MFGM

原文Fig. 2 The first two principal components according to quantitative iTRAQ expressed proteins. Numbers refer to identified proteins using a proteomic approach. RCM represents human normal MFGM. RFM refers to human colostrum MFGM. BCM represents bovine normal MFGM. BFM refers to bovine colostrum MFGM. (A) PCA score plot. (B) PCA correlation loading (X) plot.

 

讨论及结论

 

    聚类分析显示,总体而言,人初乳和成熟乳MFGM蛋白具有相似的蛋白组学模式,牛初乳和成熟乳MFGM蛋白也具有相似的蛋白组学模式,人乳和牛乳MFGM蛋白之间也显示出一定的相似性。不论是人乳还是牛乳,不同泌乳时期的乳汁中MFGM蛋白显示出一定的相似性,但是部分MFGM蛋白随泌乳时期的不同表达量显著上调——与人初乳MFGM蛋白相比,人成熟乳中有111种蛋白表达量上调;与牛初乳相比,牛成熟乳中有110种MFGM蛋白表达量上调。此外,牛乳MFGM蛋白与人乳MFGM蛋白在表达量上也存在一定差异——与牛初乳相比,人初乳MFGM中有119种蛋白表达量上调;与牛成熟乳相比,人成熟乳中有112种蛋白表达量发生上调。该研究还发现,母乳初乳的乳脂球膜蛋白中含有更多和免疫功能相关的蛋白。在为期12个月的泌乳期中,母乳中存在9种在含量上有显著差异的主要乳脂球膜蛋白结构。随着婴儿的生长发育,婴儿自身的免疫系统逐渐完善,乳汁中与免疫相关的蛋白质的表达也在这一过程中逐渐减弱,而与生长相关的蛋白质的表达则逐渐增强。

 

    相对已有研究,该研究对于母乳和牛乳中的乳脂球膜蛋白组学进行了更加深入和全面的比较,亦分析了其随泌乳时间的变化和功能分类,可以帮助我们更好地了解母乳中的功能成分。研究结果提示,不同泌乳时期的人乳与牛乳MFGM蛋白表达量存在显著差异。

 

    因此,根据不同哺乳阶段婴幼儿的营养需求,可以在相应的牛乳中添加功能蛋白。这能够为以牛乳为原料的婴幼儿产品添加功能性蛋白提供理论依据,可能为乳品行业提供有用的信息和潜在的发展方向。

 

参考文献:

[1]Mather IH, Keenan TW. Origin and secretion of milk lipids. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 1998, 3(3): 259-73.

[2]Keenan TW. Milk lipid globules and their surrounding membrane: a brief history and perspectives for future research. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2001, 6(3): 365-71.

[3] Heid HW, Keenan TW. Intracellular origin and secretion of milk fat globules. Eur J Cell Biol, 2005, 84(2-3): 245-58.

[4] Timby N, Domellöf M, Lönnerdal B, et al. Supplementation of Infant Formula with Bovine Milk Fat Globule Membranes. Adv Nutr, 2017, 8(2): 351-5.

[5] El-Loly MM, et al. Composition, properties and nutritional aspects of milk fat globule membrane – a review. Pol J Food Nutri Sci, 2011, 61(1): 7-32.

[6]乔发东. 乳脂肪球膜的组成与应用研究进展. 中国乳品工业, 2011, 第11期: 35-8.

[7]张波, 等. 乳脂球膜与婴幼儿脑发育及健康的研究进展. 中国儿童健康杂志, 2016, 24(1):43-7.

[8]Yang M, Cong M, Peng X, et al. Quantitative proteomic analysis of milk fat globule membrane (MFGM) proteins in human and bovine colostrum and mature milk samples through iTRAQ labeling. Food Funct, 2016, 7(5): 2438-50.351-5.

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